檢測一個基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對變化，方法是western blot。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中要求有良好的參照體系，對實驗結(jié)果分析是非常有用的。

我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對多少，前提條件是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。艾美捷向您推薦使用內(nèi)參抗體來檢測您的實驗系統(tǒng)，或者校準(zhǔn)您的實驗結(jié)果。內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control)，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實驗結(jié)果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實驗時，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實驗，至內(nèi)參量一致為止;若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結(jié)果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌?/p>

常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin，這其中zui近的國外文獻(xiàn)報道中使用GAPDH內(nèi)參的較多。對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內(nèi)參;同樣的，如果提取的樣本是細(xì)胞核蛋白，那么PCNA或者組蛋白H3都是被經(jīng)常使用的;而針對一些研究線粒體的客戶，那么Cox IV則被較多的文獻(xiàn)引用作為線粒體總蛋白的內(nèi)部參考。