3操作技術 
　　操作過程的控制：①嚴格按照試劑說明操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60 min。②加樣后及時放入孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*。③封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導致“盎”灞的出現(xiàn)。④用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干；還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象。⑤合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。⑥加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。⑦顯色劑盡量在臨用前配制，不使用過期顯色劑，肉眼可見淺藍的TM顯色劑不用。⑧加樣時保持顯色劑不外流；A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時要避免產(chǎn)生氣泡。⑨應保證酶標板清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以得到更準確、更可靠的實驗結果。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性直接影響檢測結果。由于吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。 
　　溫浴影響。在建立ELISA方法時做反應動力學研究。實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1～2 h，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。反應板孔、反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。溫育的溫度和時間應嚴格按規(guī)定控制，特別要注意邊緣位置。96孔酶標板結構特別，易產(chǎn)生邊緣效應，抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周邊孔與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。 
　　洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELISA應是靠洗滌來達到分離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固體相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎隨意。

　　洗滌液多為含非離子性洗滌劑中的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，又含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質(zhì)恢復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度為0.005%～0.02%，高于0.02%可使包被在固相上的抗原或抗體借吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導率小于1.5 μs/cm，洗液如果結晶應待其溶解后配制。手洗條件一致性較差，對結果影響較大。半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結果，血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞，造成未結合標記酶洗脫不*，導致“花板”，造成假陽性或假陰性。所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清洗幾遍。 
　　保證洗板浸泡時間為40 s左右，孔內(nèi)液體被洗板機洗得越干凈越好。 
　　4顯色和比色 
　　TMB經(jīng)HRP作用后，約40 min顯色達，隨即逐漸減弱，至2 h后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮納和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12～14 h）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色，此時可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、度和可測范圍、線性等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001，使用前先預熱儀器15～30 min，測讀結果更穩(wěn)定。 
　　測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492 nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長（W1），第二在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置，zui終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 
　　肉眼判斷結果時，顯色淺不易觀察，影響結果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結果一致性。 
　　5 HOOK效應 
　　隨著ELISA一步法的應用，一些標本中抗原含量過高，產(chǎn)生HOOK效應。影響檢測結果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減少HOOK反應的發(fā)生。 
　　6干擾物質(zhì) 
　　有人認為大約40%的科研血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結果。常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)原性誘導的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的Fc段結合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構，F(xiàn)c的C1q分子結合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃ 30 min滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦）在儲存過程中可能形成二聚體，會導致本底過深，影響檢測結果。 
　　7藥物的影響 
　　價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)。如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200 mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出，而且其所生的新生兒常出現(xiàn)HBsAg陰性、HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式，可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體與通過胎盤進入胎兒血液中的HBsAg結合形成復合物，則新生兒HBsAg檢測呈陰性，用0.5 mol的鹽酸處理標本1 h可提高檢出率。 
　　為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的12周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成分，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗的主要成分HBsAg，有方法能夠把它檢出，如電化學發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應做HBsAg檢測。 
　　8 抗原自身因素 
　　融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應而產(chǎn)生了可疑標本。 
　　少數(shù)HBV感染后外周血中不含HBsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量為5 μg/ml～600 μg/ml。據(jù)文獻報道，到目前為止在獻血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg攜帶者zui低含量為0.2 ng/ml，含量高者可達2 000 μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機體產(chǎn)生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。zui近，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變（氨基酸58～118）是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。 
　　總之，的試劑、狀態(tài)良好的儀器、排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。